Ang mga enzymes sa pagbabawal ay mga enzymes na nagpaputok ng parehong single at double-stranded na DNA. Ang bawat paghihigpit na enzyme ay may isang tukoy na nukleotide na pagkakasunud-sunod, na tinatawag na isang lugar ng pagbabawal, na kinikilala at binubura nito. Ang mga enzymes sa pagbabawal ay ginagamit para sa DNA sequencing, mutational analysis, at cloning at amplification ng DNA. Ang mga siyentipiko ay gumagamit ng mga enzyme sa paghihigpit upang magpasok ng mga gene ng interes sa mga vectors na expression, mga molecule ng DNA na maaaring magtiklop nang hiwalay mula sa chromosomal DNA. Ang vector na naglalaman ng gene ng interes ay maaaring ipakilala sa isang bakterya para sa pagpapahayag at paglalarawan ng mga protina.
Video ng Araw
Hakbang 1
Kilalanin ang mga site ng enzyme sa pagbabawas sa iyong vector sa pamamagitan ng pagtingin sa mapa ng paghihigpit. Sasabihin sa iyo ng mapa ng paghihigpit kung anong mga enzymes ang gupitin ang iyong vector, at kung saan.
Hakbang 2
Pumili ng isang enzyme ng paghihigpit na mayroon ding isang site na naroroon sa iyong REPLACE ng gene, sa pamamagitan ng pagtingin sa pagkakasunud-sunod ng REPLACE. Tiyakin na ang lugar ng pagbabawal ay nasa posisyon sa iyong REPLACE na nasa labas ng gene ng interes, kaya hindi mo mawawalan ng anumang bahagi ng gene.
Hakbang 3
Tiyakin na walang mga duplicate ng site ng paghihigpit sa kahit saan sa iyong REPLACE o gene ng gene. Ito ay magdudulot ng maraming pagbawas sa iyong DNA at bigyan ka ng nakaliligaw na data.
Hakbang 4
Subukan na pumili ng mga enzymes na paghihigpit na pinutol ng malagkit na dulo, kaysa sa mga dulo ng mapurol. Ang mga dulo ng sticky ay nangyayari kapag binawasan ng enzyme ang double stranded DNA sa isang staggered paraan, nag-iwan ng isang stranded overhang na facilitates attachment sa isang REPLACE cut sa kabaligtaran paraan. Ang mga dulo ng blunt ay nangyayari kapag ang double-stranded DNA ay pinutol sa isang makinis na paraan, at ang mga ito ay mas mahirap na ilakip.
Hakbang 5
Pumili ng ibang enzyme sa paghihigpit para sa parehong mga dulo ng iyong REPLACE upang matiyak na ito ay ipinasok sa vector sa wastong orientation at upang matiyak na ang vector ay hindi muling i-attach sa sarili nito.
Hakbang 6
Subukan na pumili ng dalawang mga enzymes ng paghihigpit na gumagana nang maayos sa parehong buffer system at temperatura. Kung hindi ito posible, patakbuhin nang hiwalay ang bawat panunaw.
Mga bagay na Kakailanganin mo
- Pagkakasunud-sunod ng REPLACE ng gene
- Mapa ng paghihigpit para sa vector ng pagpili
- Listahan ng mga enzymes ng paghihigpit at kanilang mga site ng hiwa
Mga Tip
- Ang ilang mga web program ay binuo upang matukoy mabilis na pag-aayos ng mga site sa isang DNA sequence. Isa sa mga naturang programa ay mula sa New England BioLabs.
